Pugliese Domenico

Riassunto in italiano
I pestivirus HoBi-like sono pestivirus emergenti che infettano il bovino, in cui causano forme cliniche sovrapponibili a quelle indotte dai virus della diarrea virale bovina (BVDV) 1 e 2. A seguito della notevole diffusione registrata negli ultimi anni, si sono resi necessari strumenti molecolari per una loro rapida discriminazione. Lo scopo del presente studio è stato quello di sviluppare una metodica multiplex real-time RT-PCR, basata sulla tecnologia TaqMan, per la rapida ed univoca caratterizzazione di tutti i pestivirus bovini, incluse le varianti emergenti HoBi-like. La metodica si è dimostrata sensibile, specifica e ripetibile, assicurando la rilevazione di 100 – 101 copie di RNA virale. Non sono state osservate cross-reazioni tra le differenti specie di pestivirus, anche in campioni artificialmente contaminati con più di un pestivirus. L’analisi di campioni di campo risultati positivi per BVDV-1, BVDV-2 e virus HoBi-like utilizzando un protocollo nested PCR ha rilevato che la metodica TaqMan messa a punto ha una sensibilità uguale o superiore rispetto alla metodica nested PCR, ed è stata in grado di discriminare correttamente le specie virali in tutti i campioni testati; al contrario una metodica real-time RT-PCR sviluppata precedentemente per la rilevazione di pestivirus HoBi-like ha mostrato cross-reazione con alcuni campioni con alti titoli di BVDV-2.
Abstract in inglese
HoBi-like pestiviruses are emerging pestiviruses that infect cattle causing clinical forms overlapping to those induced by bovine viral diarrhea virus (BVDV) 1 and 2. As a consequence of their widespread distribution reported in recent years, molecular tools for rapid discrimination among pestiviruses infecting cattle are needed. The aim of the present study was to develop a multiplex real-time RT-PCR assay, based on the TaqMan technology, for the rapid and unambiguous characterisation of all bovine pestiviruses, including the emerging HoBi-like strains. The assay was found to be sensitive, specific and repeatable, ensuring detection of as few as 100-101 viral RNA copies. No cross-reactions between different pestiviral species were observed even in samples artificially contaminated with more than one pestivirus. Analysis of field samples tested positive for BVDV-1, BVDV-2 or HoBi-like virus by a nested PCR protocol revealed that the developed TaqMan assay had equal or higher sensitivity and was able to discriminate correctly the viral species in all tested samples, whereas a real-time RT-PCR assay previously developed for HoBi-like pestivirus detection showed cross-reactivity with few high-titre BVDV-2 samples.